서강대학교 현대생물학실험3 (현생실3) 동물 세포 배양, dna 손상 (A+)

소개

"서강대학교 현대생물학실험3 (현생실3) 동물 세포 배양, dna 손상 (A+)"에 대한 내용입니다.

목차

1. Abstract

2. Introduction

3. Material & Method

4. Result

5. Discussion

6. References

본문내용

본 실험은 세포배양 방법을 배우고 DNA damage에 대한 cell의 복구 기작을 이해하는 데 그 목적이 있다. 백인 남성에서 얻은 keratinocyte cell line인 HaCaT cell이 사용되었다. Trypsin-EDTA로 adherent cell을 표면에서 분리하고 trypan blue를 사용해 살아있는 세포 수를 counting 한다. 실험 결과 average cell number는 1.35 cell/ml이고, total cell number는 6.75 cell/ml로 도출되었다.
subculture 전 cell은 빽빽하고 polygonal 한 형태였으며, subculture 후 cell은 밀도가 낮아지고 둥글게 관찰되었다. DMSO를 사용해 ice 형성을 최소화하며 -20°C, -80°C, -196°C의 단계적으로 freezing을 진행한다. freezing 된 cell을 다시 사용하는 thawing은 37°C water bath에서 2-3 min 동안 빠르게 진행하여 손상을 최소화하였다. 이후 doxorubicin을 처리하여 DNA double-strand break를 유도하고 생성된 γH2AX를 western blot과 ICC(immunocytochemistry)를 통해 확인하였다. western blot에서는 tubulin과 γH2AX antibody를 1차 항체로 사용하였고, HRP-conjugated antibody를 2차 항체로 사용하였다. 실험 결과 55 kDa와 15 kDa 모두에서 control, doxo 처리 sample의 band가 관찰되었다. housekeeping gene으로 사용된 55 kDa(tubulin) band가 control에서 더 진한 것으로 보아 doxo 처리 sample에서 더 많은 양의 γH2AX가 형성되었음을 알 수 있다. ICC는 fixation, permeabilization 한 후에 1차 항체로 γH2AX antibody, 2차 항체로 FITC-conjugated antibody를 사용하였다.

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